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茶树菇活性提取物抗氧化和延缓衰老作用的研究

01.19.2017

茶树菇(Ag_rocybe aegerta)又名茶薪菇,它是一种珍稀的食用菌。茶树菇有清热、平肝、明目、利尿、健脾之功效。研究表明,茶树菇具有提高免疫功能和抑瘤作用。树菇抗氧化和延缓衰老作用的研究尚未见报道。我们通过果蝇生存测验和小鼠生理生化试验研究茶树菇活性提取物(简称BEAAbioact ive extract fromAgrocybe aegerl ta)抗氧化和延缓衰老作用,为开发新的保健食品和药品提供科学依据。

1对象与方法

11材料

(1)茶树菇,广东省微生物研究所提供。(2)野生型纯种黑腹果蝇(DrosophYla melanogaster),华南师范大学生命科学学院提供。(3)昆明种小鼠,SPF级,2月龄,体重20±29,广州中医药大学动物实验中心提供。(4)SOD(Superoxideditase,超氧化物歧化酶)试剂盒、LF(Lipofuscin,脂褐素)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。(5)D一半乳糖购自上海伯奥生物科技公司。

12方法

121茶树菇活性物质的原态提取:取茶树菇子实体,依次用纯水、无水乙醇和石油醚浸泡24h,定性滤纸抽滤2次,滤液用旋转蒸发仪60℃浓缩,置干燥箱60℃干燥至恒重,混匀这3种溶剂所提取的活性成份备用哺1。茶树菇活性提取物经检测,其主要成分为总糖含量为3873%,粗蛋白含量

234%,粗脂肪含量398%。

122果蝇生存测验:参照钟耀广的方法配制基础培养基,培养管采用75mm×15mm的试管,每管用注射器注射培养基15ml,以棉花塞封口,培养管斜放以使培养基形成约40。斜面。取成熟野生型黑腹果蝇于装有基础培养基的50ml三角锥瓶内交配产卵,在形成蛹时去掉亲本蝇,收取10h内羽化的果蝇,用乙醚将其麻醉后,即分雌雄,挑取体型大小相近的果蝇随机分为空白对照、茶树菇低(LBEAA)、中(M-BEAA)和高(HBE)剂量组,分别用不含BEAA、含BEAA浓度520809L的培养基培养。每组共用160只果蝇,雌雄各半,各分装于4支管内,每管20只果蝇。给药组的果蝇在基础培养基培养到D12后,转到含不同BEAA浓度的培养基培养直至其全部死亡。实验在(25±1)℃,相对湿度(50"--'70)%的培养箱内进行。每4d更换新鲜配制的培养基1次。每天定时统计果蝇死亡数直至果蝇全部死亡。实验结束后计算每组的平均寿命、半数死亡时间和最高寿命(每组最后死亡的10只果蝇的平均存活天数为该组的最高寿命)。。

123小鼠生理生化试验:将小鼠随机分成空白对照、造模组和LBEAAMBEAAH-BEAA五个组,每组10只,雌雄各半,自由进食基础饲料和水。造模组、LBEAAMBEAAH-BEAA组均每天颈背部皮下注射01 ml D一半乳糖溶液,剂量为 120 mgkgd),空白对照组注射等量的生理盐水,均连续注射42dL-BEAAMBEAAH-BEAA三个组分别灌胃50200800 mg(kg·d)BEAA,体积皆为02l,空白对照组和造模组分别灌胃等量蒸馏水,均连续灌胃42d。实验结束时,断头法取血,用黄嘌呤氧化酶法测定小鼠血清SOD活性,取肝制成活性肝匀浆用荧光比色法测定其LF含量(SODLF的测定方法均参照试剂盒说明书),取脾和脑测定脾指数和脑指数(脏器鲜重/体重)

124茶树菇活性提取物急性毒理试验:将小鼠随机分成空白对照组和给药组,每组20只,雌雄各半,自由进食基础饲料和水。实验前12 h禁食但不禁水,给药组一次性灌胃给药,每只灌胃量20 gkg(小鼠正常用量100)茶树菇活性提取物,空白对照组灌胃蒸馏水,体积皆为05ml。给药后常规饲养,连续观察14 d内小鼠活动、呼吸、毛色等表观情况是否有异常和记录死亡情况。实验结束时处死解剖观察心、肝、脾、肺、肾等是否异常(颜色、组织坏死、肿大等),并测肝指数、肾指数、胸腺指数(脏器鲜重/体重)

125数据统计:采用DPS 301软件进行统计,采用LSD(最小显著性差异法)作方差分析。

2结果

21 BEAA对果蝇寿命的影响

52080gL BEAA都能极显著延长雄性果蝇的平均寿命和半数死亡时间,平均寿命延长率分别达3568%、4184%和2105(p<001),半数死亡时间分别延长了6173%、5426%和4788(p<001)20%LBEAA也能延长雌性果蝇平均寿命,平均寿命延长率为1216(p<001)52080gLBEAA使雌性果蝇的半数死亡时间分别延长了1429%、2857%和1031(p<005)。合适的剂量(20gL)具较好延寿效果,剂量太高或太低都会减弱其延寿效果。在同一剂量组中,BEAA对雄性果蝇延寿效果比对雌性果蝇好。

22 BEAA对小鼠SODLF、脾指数和脑指数影响

BEAA 800 mg(kg·d)剂量能使雄性小鼠血清SOD活性提高4236(P<005)、肝LF含量降低5006(p<001)、脑指数增加1785(p<005)、脾指数增加3333%。200 mg(kg·d) BEAA也能使雄性小鼠SOD提高2730%、LF降低3654(P<001)、脾指数增加3333%、脑指数增加1071%。BEAA对雄性小鼠SODLF、脾指数、脑指数都有明显的量效关系,其效果都随着BEAA剂量的增加而增强.

800 mg(kg d)BEAA能使雌性小鼠肝LF含量降低3563(p<001)、脾指数增加3000

(p<005)、脑指数增加1476(p<005)200 mg(kg·d)BEAA能使雌性小鼠肝LF含量降低2936(p<005)、脾指数增加4000(p<O01)、脑指数增加2282(p<001)50 mg(kg·d)BEAA也能使雌性小鼠肝LF含量降低4103(p<001)、脑指数增加1409(P<005)。对于雌性小鼠的SOD、脾指数和脑指数,以中剂量的BEAA作用较好。可知,BEAA对雄性小鼠的延缓衰老作用优于对雌性小鼠的。

23茶树菇活性提取物急性毒理试验

给药后实验组小鼠饮食正常,活动自如,毛色光滑,呼吸正常,大小便正常,无异常分泌物,无任何不良反应,无一死亡。连续观察14d后,经解剖和病理检查,心、肝、脾、肺、肾等主要脏器无组织坏死、肿大、颜色异常等病理症状。与空白对照组比较,体重、肝指数、肾指数、胸腺指数没有显著差异。这表明小鼠对茶树菇活性提取物的耐受量至少为20 g(kg·d)

3讨论

31 BEAA对果蝇的延寿效果

在果蝇生存测验中,平均寿命是药效的综合反映,半数死亡时间偏向于反映药物对体弱果蝇的延寿效果,最高寿命则偏向于反映药物对强壮的果蝇的延寿效果以及果蝇对某药物过多摄取的耐受力。本研究结果表明,BEAA对延长半数死亡时间都有比较好的效果,其延长率都比同组的平均寿命延长率高,而延长最高寿命的作用则不明显。这表明BEAA能很好地增强体弱果蝇的体质,从而延长其寿命,但长期过量摄取会减弱延寿效果。本研究表明,209LBEAA具有较好的延寿效果,剂量太高或太低都会减弱其作用。

32 BEAA的抗氧化和延缓衰老作用

随着年龄的增长,机体SOD等抗氧化酶活性不断下降,导致机体代谢过程中不断产生的自由基而不能及时清除,过剩的活性氧引起膜脂、蛋白质、DNA等多种生物大分子变性、断裂,引起细胞结构和功能的破坏,导致机体衰老。LF即老年色素,是人和动物老化的代谢产物,反映机体氧化损伤程度。茶树菇水提液能有效清除·0HO2,抑制0H生成。茶树菇甲醇提取液也有清除自由基作用和抑制小鼠脑脂质过氧化反应。100 ggml的茶树菇甲醇提取液脂肪酸流分对环加氧酶一1活性、环加氧酶一2活性和脂质体过氧化反应的抑制率分别为80%、88%和75%旧1。本研究结果表明,800 mg(kgd)BEAA能使雄性小鼠血清SOD活性提高4236%,肝LF含量减少5006%。这表明BEAA具有良好的抗氧化作用,从而发挥其延缓衰老功效。

人体和动物的衰老与免疫防御功能的健全状况有密切关系。随着年龄的增加,各免疫器官日渐萎缩。茶树菇多糖能显著提高小鼠的脾指数和吞噬百分率旧1,对环磷酰胺所致的白细胞数下降有拮抗作用…。茶树菇的抗肿瘤外源凝集素AAL对人和小鼠的肿瘤细胞具很好的抑制作用口]。本研究表明,BEAA能极显著提高雌性小鼠脾指数。这提示BEAA能有效调节免疫功能从而延年益寿。此外,研究表明,脑指数随着年龄的增长而下降,BEAA能使雌性小鼠脑指数提高2282%,从而延缓衰老。

食药用真菌的延缓衰老作用具有性别差异性。研究表明,栎金钱菌、松茸、云芝的活性提取物对雄性果蝇的延寿效果都是优于雌性的哺,。本实验的果蝇生存测验和小鼠试验结果都表明,BE从对雄性的延缓衰老效果比对雌性的好。BEAA对小鼠抗氧化和延缓衰老作用的最佳剂量因不同性别而异。本研究表明BEAA对雄性小鼠抗氧化和延缓衰老作用随着剂量的增加而增强,但对雌性小鼠的抗氧化和延缓衰老作用则是以中剂量(200 mgkg·d)的效果最佳。

本研究结果表明,BEAA能极显著地延长果蝇的平均寿命、半数死亡时间,显著地提高衰老模型小鼠血清SOD活性、降低肝LF含量、提高脾指数和脑指数,具有良好的抗氧化和延缓衰老作用。急性毒理试验表明,BEAA没有明显的毒副作用和不良反应,对雌、雄性小鼠灌胃给药BEAA的耐受量至少为209(kgd),茶树菇活性提取物属于实际无毒级物质。这为新的保健食品和药品的开发提供了实验依据。

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